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El diagnóstico de la enfermedad de Sanfilippo. Laura Gort y Mª José Coll

El diagnóstico de la enfermedad de Sanfilippo. Laura Gort y Mª José Coll

La enfermedad de Sanfilippo es un grupo de cuatro síndromes diferentes, que todos se caracterizan por la excreción aumentada en orina del glucosaminoglicano heparán sulfato. Cada uno de estos síndromes es consecuencia de un déficit enzimático específico implicado en la degradación del heparán sulfato. Según el defecto enzimático se clasifican en los tipos A, B, C y D. Estas enfermedades pertenecen al grupo de las llamadas mucopolisacaridosis, que están dentro de las denominadas enfermedades lisosomales, que incluyen 6 entidades distintas. La enfermedad de Sanfilippo es la mucopolisacaridosis III.
Dentro de las enfermedades lisosomales las mucopolisacaridosis son, el  segundo grupo de enfermedades  con más afectados, y en nuestra población representan un 33% de todos los pacientes. Los tipos I y II son los más frecuentes, aunque si se toman todas las MPS III en conjunto (tipos A, B, C y D) son las más frecuentes de este grupo de enfermedades.
Se diagnostican aproximadamente unos 5-7 nuevos casos nuevos cada año de enfermedad de Sanfilippo en España.  

Diagnóstico de la enfermedad de Sanfilippo

El diagnóstico de las mucopolisacaridosis se realiza mediante un primer análisis en orina de la excreción de glucosaminoglucanos (GAGs). Una vez detectado un exceso de excreción de GAGs, típico de las mucopolisacaridosis, se procede a la tipificación de estos, para identificar el tipo de GAG que se excreta. La detección de queratán sulfato, dermatán sulfato o heparán sulfato, nos indica cual de las mucopolisacaridosis puede padecer el paciente. En el caso de la enfermedad de Sanfilippo, los pacientes afectos excretan niveles aumentados de heparán sulfato en orina.
Después de la orientación del estudio en orina, se procede al estudio bioquímico para identificar el déficit enzimático concreto que causa la enfermedad (Figura 1).

El análisis enzimático se puede realizar en leucocitos extraídos de sangre total o en fibroblastos cultivados a partir de biopsia de piel.
El déficit se confirma mediante el estudio de la actividad enzimática concreta en el laboratorio utilizando un sustrato sintético.
La reacción natural de los enzimas es aquella por la cual una hidrolasa o enzima activa degrada un sustrato en un producto y un residuo. Si la enzima no está activa no puede degradar el sustrato y éste se acumula en las células causando la patología (Figura 2)

Basándose en este principio, en el laboratorio se utiliza un sustrato sintético unido a una molécula llamada 4-Metilumbeliferona. Esta molécula tiene la propiedad que cuando está libre en un medio a pH básico emite fluorescencia, mientras que si está unida a cualquier otra molécula no la emite. Esta propiedad se utiliza para diferenciar si la enzima está activa o no, midiendo la cantidad de fluorescencia que hay en el medio de reacción. Si se detecta fluorescencia, la enzima está activa y es capaz de degradar el sustrato específico y liberar la 4-Metilumbeliferona, si la enzima está defectuosa, no va a ser capaz de degradar el sustrato y liberarla y, por tanto, no se va a detectar fluorescencia (Figura 3).

Si se detecta actividad en las células del paciente, se descarta esa enfermedad, si no se detecta actividad, significa que el enzima está deficiente y que el paciente está afecto de esa patología. En el caso de la enfermedad de Sanfilippo, se analizan cuatro enzimas diferentes para identificar el tipo de la enfermedad:

  • Sanfilippo A .- Heparan-N-Sulfatasa o Sulfamidasa
  • Sanfilippo B .- Alfa-D-N-Acetilglucosaminidasa
  • Sanfilippo C .- Acetil-coA-Alfa-glucosaminidtransferasa
  • Sanfilippo D.- N-Acetilglucosamina-6-sulfatasa

Una vez detectado cual de las enzimas es deficitaria, el paciente queda diagnosticado de enfermedad de Sanfilippo del tipo concreto detectado.
Sabiendo el diagnóstico de la enfermedad en el paciente, es posible realizar el diagnóstico prenatal bioquímico en un nuevo embarazo de los padres

Diagnóstico molecular de la enfermedad de Sanfilippo

Una vez identificada la enfermedad del paciente y el tipo concreto de Sanfilippo que padece, se procede al estudio molecular del gen responsable de ésta. El estudio molecular es importante y muy útil, pues permite:

  • La detección de las mutaciones responsables de la enfermedad en el paciente
  • El estudio de portadores en la familia
  • El estudio prenatal

Asimismo, teniendo en cuenta que algunas terapias que actualmente están en estudio son mutación-dependiente, el saber las mutaciones responsables de la enfermedad en el paciente, le hace válido o no para ciertas terapias concretas, mientras que para otras, el saber o no la mutación concreta no aporta ninguna información extra sobre la idoneidad del paciente.

Para el estudio molecular se analiza el gen que codifica para el enzima que está deficitario en el paciente. Para la enfermedad de Sanfilippo se analizan los genes correspondientes a cada tipo:

  • Sanfilippo A .- SGSH
  • Sanfilippo B .- NAGLU
  • Sanfilippo C .- HGSNAT
  • Sanfilippo D .- GNS

El estudio molecular de cualquier gen se realiza mediante la amplificación por PCR y posterior secuenciación del DNA del paciente para comprobar si la secuencia de DNA es correcta y codifica correctamente para la proteína correspondiente.

Una vez identificadas las mutaciones responsables de la enfermedad en el paciente diagnosticado, se procede al estudio de los padres para identificar la procedencia y herencia de las mutaciones en la familia. También se puede ofrecer el estudio de portadores al resto de la familia.

Terminología del estudio molecular

El DNA es una cadena de nucleótidos que codifica para todas las proteínas y componentes necesarios para el funcionamiento de las células.
Un gen es un segmento corto de DNA, que codifica para una
Una proteína es una cadena de componentes llamados aminoácidos. Para que la proteína funcione bien, esta cadena tiene que ser siempre igual y con la misma conformación.
Esta cadena de aminoácidos está codificada por el DNA, de forma que cada tres nucleótidos de la cadena de DNA, codifican para un aminoácido. Esta cadena de DNA tiene que ser siempre igual con la misma secuencia de nucleótidos para que, leída de tres en tres, codifique siempre para la misma cadena de aminoácidos y en el mismo orden.
Las mutaciones son cambios que se dan en el DNA del gen que codifica para una proteína concreta. Estas mutaciones causan que la cadena de DNA sea distinta de lo que debería ser, por lo que cuando es leída para codificar los aminoácidos, provoca que la cadena de aminoácidos sea diferente, que la proteína no sea igual, y por tanto, que no sea activa.
Hay distintos tipos de mutaciones:

  • Mutación missense o de cambio de sentido.- Provoca el cambio de un aminoácido por otro en la misma posición
  • Mutación nonsense o sin sentido.- Provoca que en lugar de un aminoácido en una posición concreta, la maquinaria de traducción interprete que la proteína ya se ha terminado y quede una proteína más corta de lo que debería ser.
  • Inserción o deleción.- Es la ganancia o pérdida de nucleótidos en el DNA de forma que al leerlos de tres en tres causa la ganancia o pérdida de uno o varios aminoácidos, alterando la estructura de la proteína
  • Splicing.- Mutación que afecta el proceso de splicing. Este proceso natural es el que se encarga de quitar los intrones o fragmentos de DNA no codificantes para la proteína. Estas mutaciones provocan que este proceso sea defectuoso y causa la inserción o deleción de fragmentos de DNA que van a codificar por aminoácidos de más o de menos en la proteína, causando que sea inactiva.

Todas las mutaciones causan que la proteína sea defectuosa, aunque depende del aminoácido o fragmento de aminoácidos afectados, la afectación es mayor o menor, de forma que, según la mutación, la proteína puede conservar cierta actividad o, por lo contrario, ser completamente inactiva.

Diagnóstico prenatal

El diagnóstico prenatal de la enfermedad de Sanfilippo es posible.
Se puede realizar en vellosidades coriales (a las 10-12 semanas de gestación) (Figura 4) o en líquido amniótico (a las 15-16 semanas de gestación) (Figura 5).
Si se tiene el genotipo (mutaciones) del caso índice, el diagnóstico prenatal puede realizarse en las vellosidades de corion sin necesidad de cultivarse, puesto que se puede extraer DNA de ellas directamente. Ello permite tener el resultado del estudio muy al principio de la gestación. El estudio molecular también se puede realizar con DNA extraído de amniocitos cultivados a partir del líquido amniótico.
Por el contrario, si no se conocen las mutaciones del caso índice tanto un las vellosidades coriales como el líquido amniótico deberán cultivarse para el análisis enzimático. En el caso del líquido amniótico, también pueden analizarse los glucosaminoglucanos presentes en el sobrenadante siendo estos una herramienta más para establecer el diagnóstico.

Laura Gort Mas y Mº José Coll Rosell

Centro de Diagnóstico Biomédico | Hospital Cínic de Barcelona

 

 

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